1 均相非放射性同位素法 上述这些非均相的方法，存在操作繁多的问题。随着技术的发展，越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。 1.1 检测剩余的ATP的量 有些方法可以利用测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo™技术。该方法利用激酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反比。该试剂盒里的重组热稳定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的“辉光”型荧光，半衰期大于5个小时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理大量的微孔板。Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适用于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来自化合物的自发荧光的干扰。 该检测方法的成本很低，但为了产生大于2倍的信噪比，至少需要50%的转化率，因此不能用于进行激酶性质的研究，但在ATP产生50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到3倍之间，处于可以接受的范围，因此该方法可适用于抑制剂的高通量筛选。 1.2 检测ADP的生成量 该类方法较易检测一些非多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定一些ATP酶的活性。该类方法又可以分为ADP偶联反应，即将ADP转化成其他物质并进行检测，例如Promega的ADPGloTM；依靠ADP抗体检测的方法，例如Invitrogen的Adapta®，Cisbio的Transcreener®等方法； 1.2.1 ADP-GloTM ADP-Glo™(原理见图1)是Promega公司开发的一种发光法激酶检测方式，检测激酶反应中所形成的ADP的量来反应激酶活性。在该检测方法中，激酶反应中剩余的ATP会首先被ADP-Glo试剂消耗掉；接下来，激酶反应中生成的ADP则会被激酶检测试剂还原成ATP；然后，ATP在Ultra-Glo™萤光素酶的作用下，与荧光素反应发光，发光信号与激酶活性正相关。ADP-Glo™可用于检测几乎任何可生成ADP的酶的活性，不需要抗体参与以及放射性标记。这种检测方法相当敏感，能够检测到的ADP的浓度下限为20 nM。Liu等利用ADP-GloTM技术筛选得到了CK2的抑制剂香豆雌酚，并分析了抑制剂的机制。 1.2.2 其他检测ADP生成量的方法 除了Promega公司的ADP-GloTM以外，很多其他公司也开发了类似检测方法，譬如DiscoveRx公司的ADP Hunter™、Cisbio公司的Transcreener™以及Life technologies公司的Adapta™。其中ADP Hunter™可以利用激酶反应中产生的ADP，将phosphoenolpyruvate, PEP转化为pyruvate，并最终转化为荧光信号。该方法可以实时监测激酶的活性变化。而Transcreener™和Adapta™则是在ADP的特异性单克隆抗体上标记铕(Eu)原子，同时再使用d2或者AlexaFluour647等荧光分子标记的ADP来竞争激酶反应的产物ADP，用于检测ADP的生成量。 1.2.3 检测ADP生成量的方法的优缺点 这些检测ADP的方法，其优点在于：(1)检测产物而非底物，因此灵敏度要远远高于检测ATP消耗量的Kinase-Glo™；(2)不仅可以应用于蛋白激酶的活性检测，同时糖激酶、脂激酶、ATP酶也可以使用此类方法进行活性测定；(3)由于很多激酶本身有内在ATP酶的活性，因此在反应体系中可以考虑不使用多肽底物，从而降低成本。当然，这些方法也有一些相对不足之处，如易受到ATP酶活性的干扰，不能测定活细胞内激酶的活性等。 1.3 检测带标记或者修饰的多肽产物 虽然上述方法可以检测激酶活性，但更多的公司选择对多肽底物进行各种修饰，并应用荧光技术进行检测，如荧光偏振(Fluorescence Polarization, FP)、荧光共轭能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)、时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)等方法。 1.3.1 荧光偏振(Fluorescence Polarization, FP) 荧光偏振技术是一种监测分子转动的技术，其原理是物质分子量的大小决定了该物质的运动和转动速度，质量越大，则转动速度和角度越小，当使用偏振光进行激发时，所获得的偏振光的角度也有所不同。荧光偏振的定义公式为P=(III - I⊥)/(III + I⊥)。其中III表示发射光和激发光平行时的荧光强度，而I⊥则表示发射光和激发光垂直时的荧光强度。荧光偏振不依赖于激发光的强度或者荧光素的浓度。当荧光素自由旋转时，其偏转角度是一个很小的数字，我们称之谓低荧光偏振；而当荧光素和其他大分子结合后，其偏转角度增大，我们称之谓高荧光偏振。 很多公司开发了相应的试剂盒，包括Bell-Brook公司的Transcreener ® FP，DiscoveRx公司的HitHunter™，Millipore公司的KinEASE™ FP，以及Molecular Devices公司的IMAP™ FP等等。荧光偏振的优点在于成本较低，均相的反应较易应用于高通量筛选；然而，由于很多因素会导致荧光分子转动速度的变化，因此有一些假阳性和假阴性的结果无法避免。 1.3.2 荧光共轭能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 荧光共轭能量转移是一种能实现完全自动化激酶活性检测方法。该方法将“受体”荧光分子和“供体”荧光分子连接在一起，当“供体”荧光分子受到激发时，能将非放射性的能量转移到“受体”荧光分子上，并发生荧光信号。市场上的相关产品众多，譬如Life Technologies公司的Z’-LYTE™以及PerkinElmer公司的AlphaScreen®等。 以Z’-LYTETM方法为例，其原理是磷酸化对多肽底物的保护作用(原理见图2)。首先，在多肽底物的N端以及C端，分别标记上“供体”荧光分子香豆素和“受体”荧光分子荧光素，这两种荧光分子的发射光谱分别为445 nm和520 nm。如果多肽底物在激酶反应中被磷酸化，就不容易受到蛋白水解酶的水解，FRET依然存在；相反，若激酶反应体系的多肽底物没有被磷酸化,未磷酸化的多肽底物会被蛋白水解酶降解，FRET不复存在。我们可以使用445 nm和520 nm的荧光强度的比率高低(S445/S520)来表示其磷酸化程度：比率越低，则多肽底物的磷酸化程度越高；反之，比率越高，则多肽底物的磷酸化程度越低。Deng等利用该方法得到抑制剂DC120对AKT的EC50值为153 nM。Z-LYTETM检测方法的优点是：(1)信噪比高，读数稳定，操作简单，便于高通量化；(2)无需抗体，试剂价格相对便宜。但此类方法也有明显的缺点：(1)容易受到蛋白水解酶的影响，无法测定多肽底物的一些相关参数，如多肽的 Km值，也不能进行一些较为复杂的抑制剂机制实验；(2)如果化合物本身有很强的自发荧光，尤其在高浓度(如10 μM)时，会对结果造成很大的影响，必须经过荧光校正；(3)如果化合物有蛋白水解酶的抑制性，就会产生假阳性的结果。